COSY против TOCSY: понимание ключевых различий и интерпретация спектров

Для структурного анализа сложных органических молекул и природных соединений двумерные гомоядерные скалярно-корреляционные ЯМР-эксперименты являются одними из наиболее полезных инструментов для разрешения неоднозначностей, вызванных перекрыванием сигналов в одномерных спектрах.

Среди наиболее широко используемых ¹H-¹H корреляционных экспериментов, COSY и TOCSY отвечают на два разных, но дополняющих друг друга вопроса.

COSY в основном используется для отслеживания локальной протон-протонной связности через наблюдаемые J-константы спин-спинового взаимодействия, в то время как TOCSY расширяет передачу намагниченности через непрерывную сеть взаимодействий и помогает идентифицировать все наблюдаемые члены одной спиновой системы.

На практике COSY помогает ответить на вопрос «Какие протоны связаны друг с другом?», в то время как TOCSY помогает ответить на вопрос «Какие протоны принадлежат к одной и той же спиновой системе?»

В этой статье рассматриваются оба эксперимента: от принципов импульсных последовательностей до практической интерпретации спектров, объясняются их ключевые различия и то, как они могут использоваться вместе в двумерной ЯМР-спектроскопии.

1. Основные функции COSY и TOCSY

COSY, или корреляционная спектроскопия, и TOCSY, или полная корреляционная спектроскопия, используют скалярное взаимодействие, или J-взаимодействие, для получения информации о корреляции протонов через химические связи.

Однако тип структурной информации, которую они призваны раскрыть, различается.

Рассмотрим непрерывно связанную протонную цепь:

H1 → H2 → H3 → H4

COSY: Локальная связность взаимодействий

COSY в первую очередь обнаруживает непосредственно наблюдаемые скалярные взаимодействия между парами протонов.

Наиболее распространенные корреляции возникают из ²J_HH и ³J_HH константы спин-спинового взаимодействия, например:

H1 ↔ H2
H2 ↔ H3
H3 ↔ H4

Эти попарные корреляции позволяют исследователям шаг за шагом выстраивать локальную связность протонов.

Иными словами, COSY-спектр особенно полезен, когда цель состоит в восстановлении последовательной связи между соседними или иным образом детектируемыми связанными протонами.

Примечание: COSY-корреляции не ограничиваются двух- и трехсвязевыми взаимодействиями. В аллильных системах, ароматических системах или жестких геометриях W-типа достаточно сильное ⁴J-взаимодействие, как правило, превышающее примерно 1,5 Гц, также может генерировать кросс-пик в COSY. Поэтому наличие одного лишь кросс-пика не следует принимать за доказательство того, что два ядра непосредственно соседствуют в молекулярной структуре.

TOCSY: отнесение всей спиновой системы

TOCSY использует другой подход.

Благодаря переносу намагниченности через J-связанную сеть, протоны в пределах одной непрерывной спиновой системы могут коррелировать, даже если два конкретных протона не проявляют сильного прямого взаимодействия друг с другом.

Поэтому его основная цель — не определение прямой связности каждой пары протонов. Вместо этого TOCSY используется для идентификации и группировки нескольких протонов, принадлежащих к одной спиновой системе.

Например, если H1, H2, H3 и H4 образуют непрерывную сеть взаимодействий, намагниченность может распространяться по последовательности:

H1 → H2 → H3 → H4

В результате в TOCSY-спектре могут появиться корреляции между более удаленными членами системы.

Примечание: Спиновая система обычно состоит из группы ядер, соединенных непрерывным путем достаточно сильных J-взаимодействий. Если эффективное взаимодействие между частями молекулы становится очень слабым или отсутствует, перенос намагниченности может прерваться. Это может произойти, когда группы разделены четвертичным углеродом, определенными конфигурациями гетероатомов или геометриями с двугранным углом, близким к 90°, где взаимодействие становится очень малым. Результатом является формирование относительно независимых спиновых систем.

2. Принципы импульсных последовательностей

Фундаментальное различие между COSY и TOCSY заключается в способе управления переносом намагниченности после периода непрямой эволюции, t₁.

2.1 COSY

Базовую импульсную последовательность COSY можно представить как:

90° - t₁ - 90° - Регистрация (t₂)

Первый 90°-импульс поворачивает продольную намагниченность в поперечную плоскость.

В течение периода эволюции t₁как химический сдвиг, так и J-спин-спиновое взаимодействие вносят вклад в эволюцию когерентности.

Второй 90°-импульс затем вызывает прямой перенос когерентности.

Когерентность, которая остается на исходном ядре, вносит вклад в диагональный сигнал в период сбора данных t₂, тогда как когерентность, перенесенная на связанное ядро, генерирует кросс-пик.

Таким образом, стандартная COSY в основном регистрирует попарные связи прямого J-спин-спинового взаимодействия.

В спектре эти корреляции обычно представляют соседние протоны или геминальные протоны, прикрепленные к одному и тому же атому углерода.

2.2 TOCSY

TOCSY вводит дополнительный период смешивания с удержанием спина после периода эволюции t₁.

Удержание спина — это не просто один длинный ВЧ-импульс. Обычно оно реализуется с использованием последовательностей составных импульсов, таких как MLEV-17 или DIPSI-2.

Во время времени смешивания эти составные импульсы создают изотропное смешивание, позволяя намагниченности распространяться по непрерывной сети J-связей.

Намагниченность сначала переносится между непосредственно связанными соседними протонами, а затем может продолжать ступенчатое движение по системе:

H1 → H2 → H3 → H4

Этот эстафетный механизм позволяет TOCSY коррелировать более удаленные члены одной и той же спиновой системы.

Время смешивания в TOCSY

Длительность периода удержания спина называется временем смешивания, и это один из наиболее важных параметров, контролирующих глубину переноса намагниченности в TOCSY.

Короткое время смешивания, например от 20 до 30 мс

Перенос намагниченности только начался. В корреляциях преобладают близлежащие связанные протоны, поэтому полученный спектр может напоминать спектр COSY.

Умеренно длительное время смешивания, например от 60 до 100 мс

Это общепринятый полезный диапазон для многих малых молекул и природных соединений. У намагниченности больше времени для распространения через непрерывную спиновую систему, что позволяет более удаленным участкам стать коррелированными.

Более длительное время смешивания

Больше — не всегда лучше.

Увеличение времени смешивания может позволить намагниченности достичь более удаленных частей сети связей, но релаксация и эффекты, связанные с РЧ-воздействием, также становятся все более значимыми.

T₂ релаксация может снизить интенсивность сигнала, в то время как РЧ-нагрев и другие экспериментальные эффекты могут способствовать потере сигнала или уширению линий. При определенных условиях импульсной последовательности и эксперимента более длительные периоды смешивания могут также усилить нежелательные эффекты релаксации или артефакты, связанные с импульсами.

По этой причине оптимальное время смешивания TOCSY следует выбирать в соответствии с размером молекулы, топологией связей, характером релаксации и интересующей спиновой системой.

3. Как интерпретировать спектры COSY и TOCSY

В 2D ¹H-¹H спектре обе оси представляют химические сдвиги протонов.

Сигналы вдоль диагонали соответствуют резонансам, наблюдаемым в обычном 1D ¹H ЯМР-спектре.

Кросс-пики, расположенные вне диагонали, указывают на то, что намагниченность была перенесена между двумя протонными резонансами через пути скалярного взаимодействия.

В зависимости от эксперимента эти корреляции могут представлять либо прямые парные взаимодействия, либо связность внутри непрерывной спиновой системы.

В следующем примере используется н-бутилацетат для иллюстрации практической интерпретации спектров COSY и TOCSY.

3.1 COSY: Пошаговое построение протонной последовательности

В н-бутилацетате карбонильный углерод не имеет присоединенного протона.

Также не наблюдается непрерывного пути протонного взаимодействия между ацетильной метильной группой и н-бутиловой цепью.

Поэтому н-бутиловую цепь можно проанализировать с помощью стратегии пошагового отслеживания.

• Начните с наиболее изолированного слабопольного протонного сигнала, H2 при приблизительно 4,0 м.д..
• Следуйте по горизонтальной линии от H2, пока не будет найден кросс-пик H2 ↔ H3 при приблизительно 1,6 м.д..
• Затем вернитесь к диагональному сигналу H3 и выполните поиск его следующей соседней корреляции. Это выявляет H3 ↔ H4 кросс-пик приблизительно при 1.4 ppm.
• Начиная с H4, продолжите тот же процесс для идентификации корреляции H4 ↔ H5 приблизительно при 0.9 ppm.

Следуя за этими отдельными парными кросс-пиками, можно шаг за шагом восстановить локальную последовательность протонной связности.

Важно отметить, что в спектре COSY отсутствуют значимые корреляции H2 ↔ H4 или H2 ↔ H5.

Это иллюстрирует одно из наиболее важных различий между COSY и TOCSY. COSY в первую очередь выявляет наблюдаемые парные связи, необходимые для построения локального протонного каркаса.

3.2 TOCSY: использование опорного сигнала для идентификации всей спиновой системы

Для спектра TOCSY, полученного с соответствующим временем смешивания, можно использовать другую стратегию интерпретации.

• Сначала выберите изолированный протонный резонанс в качестве опорного сигнала. В этом примере H2 приблизительно при 4.0 ppm является удобным опорным сигналом, поскольку он хорошо отделен от других протонных сигналов.
• Затем проведите горизонтальную линию на химическом сдвиге H2.
• Вдоль этой линии диагональный пик H2 появляется вместе с кросс-пиками, коррелирующими H2 с H3, H4 и H5.
• Напротив, протон ацетильной метильной группы H1 не появляется вдоль этой линии.

Таким образом, эти сигналы могут быть отнесены к одной и той же спиновой системе n-бутила.

Отсутствие H1 на этой линии указывает на то, что ацетильная метильная группа и протоны n-бутила принадлежат к разным спиновым системам в данных условиях.

Этот подход становится особенно полезным для более сложных молекул.

В пептидах, например, в качестве опорного сигнала можно использовать сигнал амидного NH или α-H. В олигосахаридах аномерный протон H-1 часто является особенно полезным опорным сигналом.

В таких системах многие промежуточные протонные резонансы могут перекрываться в узкой области химических сдвигов. Поэтому пошаговое отнесение сигналов в COSY может стать затруднительным или прерываться из-за сильного спектрального перекрывания. TOCSY может помочь обойти эту проблему, позволяя корреляциям распространяться по всей связанной сети, что дает возможность классифицировать сигналы по спиновым системам, даже когда отдельные промежуточные резонансы трудно различить.

4. COSY против TOCSY: основные различия с первого взгляда

Таким образом, COSY и TOCSY не являются конкурирующими экспериментами.

Они предоставляют разные уровни структурной информации и часто наиболее полезны при совместной интерпретации.

5. Часто задаваемые вопросы

1. Всегда ли лучше более длительное время смешивания в TOCSY?

Нет.

Для обычных малых молекул 60–100 мс часто является разумным диапазоном для начала тестирования.

Для более сложных образцов может быть полезно получить два набора данных для сравнения, например, короткое время смешивания от 20 до 30 мс и относительно длительное время смешивания 80–100 мс.

При коротком периоде смешивания в спектре преобладают корреляции между близлежащими протонами. Более длительный период смешивания может выявить более отдаленные корреляции внутри одной и той же спиновой системы.

Оптимальное значение, однако, зависит от нескольких экспериментальных факторов, включая J-связь, поведение релаксации, растворитель, температуру, характеристики датчика и ВЧ-мощность. Поэтому время смешивания следует оптимизировать для конкретного образца и экспериментальной задачи, а не просто максимизировать.

2. Если кросс-пик не наблюдается, можно ли сделать вывод, что два протона не являются соседними или связанными?

Нет.

Отсутствие видимого кросс-пика не обязательно означает, что два ядра не связаны.

Например, согласно соотношению Карплуса, определенные двугранные углы могут значительно уменьшить ³J-константу спин-спинового взаимодействия.

Перекрестный пик также может быть трудно наблюдать, если он расположен близко к диагонали и перекрывается диагональными «хвостами».

Обменивающиеся протоны могут подвергаться быстрому химическому обмену, что приводит к значительному уширению линий.

В TOCSY слишком короткое время смешивания также может помешать намагниченности достичь более удаленных членов спиновой системы.

Поэтому вывод об «отсутствии взаимодействия» не должен основываться только на отсутствии перекрестного пика. Интерпретация также должна учитывать хартины расщепления в 1D, дополнительные данные 2D ЯМР и параметры сбора данных, использованные для эксперимента.

3. Каковы преимущества экспериментов с градиентным усилением, таких как gCOSY и gTOCSY?

Импульсные градиенты поля, или PFG, могут использоваться для выбора конкретных путей переноса когерентности и подавления некоторого t₁ шума и артефактов.

По сравнению с некоторыми обычными экспериментами с фазовым циклированием, последовательности с градиентным усилением также могут сократить количество необходимых сканирований.

Фактическая экономия времени на приборе зависит от конкретной импульсной последовательности и параметров сбора данных.

Однако градиентная селекция не может компенсировать фундаментальные экспериментальные проблемы. Плохое шиммирование, неточная калибровка импульсов, неадекватное подавление сигнала растворителя или недостаточная дискретизация в непрямом измерении все еще могут ухудшить качество спектра. Хорошая базовая настройка эксперимента остается необходимой для получения надежных спектров COSY и TOCSY.

Выбор между COSY и TOCSY на практике

COSY и TOCSY образуют одну из самых полезных комбинаций в 2D ЯМР-спектроскопии.

COSY помогает установить, какие протоны демонстрируют прямые наблюдаемые J-связи, что делает его особенно полезным для отслеживания локальной связности.

TOCSY помогает определить, какие протоны принадлежат к одной и той же спиновой системе, позволяя исследователям группировать связанные резонансы, даже когда отдельные промежуточные пики перекрываются или удаленные протоны не показывают сильной прямой корреляции.

Ключ к успеху — определить структурный вопрос перед выбором эксперимента.

Если цель состоит в том, чтобы проследить локальную последовательность протонов, COSY часто является естественной отправной точкой. Если цель состоит в том, чтобы идентифицировать членов всей связанной спиновой системы, TOCSY может предоставить необходимую дополнительную информацию.

Высококачественные спектры ЯМР являются основой надежного структурного анализа. ЯМР-спектрометры для жидкостей серии CIQTEK CAN сочетают в себе стабильную магнитную систему с обширной библиотекой импульсных последовательностей, поддерживая эксперименты от рутинного 1D ЯМР до широкого спектра методов 2D ЯМР для исследований и преподавания в области химии, материаловедения, биомедицины и смежных дисциплин.

ЯМР-спектрометры для жидкостей CIQTEK CAN400 и CAN600

При интерпретации спектров COSY или TOCSY самая сложная часть часто заключается не в сборе большего количества корреляций, а в понимании того, что именно каждый перекрестный пик говорит, а что — нет.