Двойной электрон-электронный резонанс (ДЭЭР) в анализе структуры ДНК - приложения ЭПР (ЭПР)

С 1950-х годов, когда Уотсон и Крик предложили классическую структуру двойной спирали ДНК, ДНК оказалась в центре исследований в области наук о жизни. Количество четырех оснований в ДНК и порядок их расположения приводят к разнообразию генов, а их пространственная структура влияет на экспрессию генов.

В дополнение к традиционной структуре двойной спирали ДНК, исследования выявили особую четырехцепочечную структуру ДНК в клетках человека, G-квадруплекс, структуру высокого уровня, образованную путем сворачивания ДНК или РНК, богатой тандемными повторами гуанина (G ), который особенно высок в быстро делящихся G-квадруплексах, особенно высок в быстро делящихся клетках (например, раковых клетках). Таким образом, G-квадруплексы можно использовать в качестве мишеней для противораковых исследований. Изучение структуры G-квадруплекса и способа его связывания со связывающими агентами важно для диагностики и лечения раковых клеток.

Схематическое изображение трехмерной структуры G-квадруплекса.
Источник изображения: Википедия

Электронно-электронный двойной резонанс (ДЭЭР)

Метод импульсного диполярного ЭПР (PDEPR) был разработан как надежный и универсальный инструмент для определения структуры в структурной и химической биологии, предоставляющий информацию о расстоянии на наноуровне с помощью методов PDEPR. При изучении структуры G-квадруплекса метод DEER в сочетании с сайт-направленным спиновым мечением (SDSL) может различать димеры G-квадруплекса разной длины и выявлять характер связывания агентов, связывающих G-квадруплекс, с димером.

Дифференциация димеров G-квадруплекса разной длины с использованием технологии DEER.

Используя Cu(пиридин)4 в качестве спиновой метки для измерения расстояния, тетрагональный планарный комплекс Cu(пиридин)4 был ковалентно связан с G-квадруплексом и расстоянием между двумя парамагнитными Cu2+. в π-сложенном четвертичном мономере G измеряли путем обнаружения диполь-дипольных взаимодействий для изучения образования димера.

[Cu2+@A4] (TTLGGG) и [Cu2+@B4] (TLGGGG) представляют собой два олигонуклеотида с разными последовательностями, где L обозначает лиганд. Результаты DEER для [Cu2+@A4]2 и [Cu2+@B4]2 показаны на рисунках 1 и 2. Из результатов DEER можно получить, что в димерах [Cu2+@A4]2 среднее расстояние одиночных Cu2+ -Cu2+ имеет dA=2,55 нм, 3'-конец G-квадруплекса образует димер G-квадруплекса за счет укладки хвост-хвост, а ось gz двух спиновых меток Cu2+ в димере G-квадруплекса выровнена параллельно.

Расстояние укладки [Cu2+@A4]2 π больше (дБ-дА = 0,66 нм) по сравнению с димерами [Cu2+@A4]2. Было подтверждено, что каждый мономер [Cu2+@B4] содержит дополнительный G-тетрамер, что полностью соответствует ожидаемым расстояниям. Таким образом, измерения расстояний методом DEER позволяют различать димеры G-квадруплекса разной длины.

Рис. 1 (А) Дифференциальный спектр импульсного ЭПР (черная линия) димера [Cu2+@A4]2 и его соответствующая модель (красная линия) (34 ГГц, 19 К); (B) После коррекции фона, четыре фазы на карте положения поля во временной области AD DEER (черная линия) и наилучший результат аппроксимации, полученный с помощью PeldorFit (красная линия); (C) Распределение расстояний, полученное с помощью PeldorFit (красная линия) и моделирования MD (серая линия); (D) [Cu2+ Равновесие между мономером @A4] и димером [Cu2+@A4]2. (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Рис. 2 (A) Диаграммы DEER во временной области (черные линии) в четырех положениях поля после коррекции фона [Cu2+@B4]2 и результаты наилучшей подгонки, полученные с помощью PeldorFit (красные линии); (Б) [Cu2+@B4]; (C) Распределение расстояний, полученное с помощью PeldorFit (красная линия) и моделирования MD (серая линия). (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Исследование способа связывания агента, связывающего G-тетрамер, с димером с использованием метода DEER.

Многие небольшие молекулы и металлокомплексы с плоскими ароматическими сопряженными системами и положительными зарядами могут связывать и стабилизировать свернутые вторичные структуры, становясь, таким образом, потенциальными противораковыми лекарствами.
N,N'-бис[2-(1-пиперидинил)этил]3,4,9,10-перилентетракарбоксикарбонилгидрохлорид (PIPER) представляет собой хорошо известный связывающий агент G-квадруплекса, который может связываться с квадруплексом и стабилизировать его путем штабелирования. а режим связывания PIPER с G-квадруплексом можно исследовать с помощью метода DEER.

На рисунках 3 и 4 показаны результаты экспериментов DEER с различными соотношениями димеров PIPER и [Cu2+@A4]2. Результаты показывают, что когда соотношение димеров PIPER и [Cu2+@A4]2 составляет 1:1 (PIPER@[Cu2+@A4]2), dP = 2,82 нм.
Увеличенное расстояние между Cu2+-Cu2+ по сравнению с чистыми димерами [Cu2+@A4]2 (dA = 2,55 нм) указывает на то, что PIPER образует сэндвич-комплекс с димером, при этом плоская органическая молекула располагается между 3'-гранями двух G. тетрамерные мономеры. Когда соотношение PIPER к димеру [Cu2+@A4]2 составляет 2:1 (2PIPER@[Cu2+@A4]2), d2P = 3,21 нм.
Дополнительное расстояние π-стекинга по сравнению с димером PIPER@[Cu2+@A4]2 (dP = 2,82 нм) указывает на вставку двух лигандов PIPER в димер G-тетрамера, расположенный «хвост к хвосту». Метод DEER может выявить новый способ связывания G-тетрамер-связывающего агента PIPER в димер G-тетрамера с образованием интеркалированных комплексов.

Рис. 3 (А) Дипольные спектры DEER с различным соотношением PIPER и димера [Cu2+@A4]2 (geff =2,061); (B) модуляция DEER с различными соотношениями глубины димера PIPER и [Cu2+@A4]2; (C) Равновесие димера [Cu2+@A4]2 и PIPER@[Cu2+@A4]2, 2PIPER@[Cu2+@A4]2, PIPER@[Cu2+@A4].
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Рис. 4 (A) Временной спектр DEER PIPER@[Cu2+@A4]2; (B) Распределение расстояний PIPER@[Cu2+@A4]2, полученное с помощью PeldorFit (красная линия) и MD-моделирования (серая линия); (C) Спектр DEER во временной области 2PIPER@[Cu2+@A4]2; (D) Распределение расстояний 2PIPER@[Cu2+@A4]2, полученное с помощью PeldorFit (красная линия) и MD-моделирования (серая линия).
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Импульсный электронный парамагнитный резонансный спектрометр CIQTEK

Импульсный спектрометр электронного парамагнитного резонанса CIQTEK EPR100 поддерживает технологию двойного электрон-электронного резонанса и может использоваться для изучения структурной локализации, функциональной интерпретации, процессов физиологического движения и интерпретации механизма действия сложных мембранных белков, ДНК, РНК, нуклеиновых кислот-белков. комплексы и родственные белковые молекулы, которые играют ключевую роль в различных заболеваниях.

Спектрометр импульсного электронного парамагнитного резонанса CIQTEK EPR100


DEER, результаты эксперимента CIQTEK EPR100

Результаты экспериментов после обработки с помощью DeerAnaанализа